|
|
The role of iron in the regulation of proteins connected with tamoxifen-resistance
Potomová, Petra ; Truksa, Jaroslav (vedoucí práce) ; Balušíková, Kamila (oponent)
Nádorové buňky jsou vysoce závislé na přísunu živin pro udržení jejich zvýšené proliferace, jedním z těchto živin je i železo. V posledních letech byla v nádorových buňkách pozorována zvýšená závislost na železe, umožňující správnou funkci mnoha enzymů, DNA syntézy a mitochondriální respirace. Zde se dále pouštíme do metabolismu železa malignantních buněk ve snaze pochopit rozdíly mezi tamoxifen citlivými a rezistentními (Tam5R) buňkami nádoru prsu luminálního A typu, MCF7 a T47D. Tyto buňky vykazují četné změny v metabolismu železa a mechanismech závislých na železe. Na základě rozdílů v proteomu Tam5R jsme se zaměřili na železnou regulaci proteinů, které jsou deregulované při rezistenci k tamoxifenu - vyhodnocením jejich regulace na transkripční (mRNA) a post-transkripční úrovni (protein) jakož i porovnáním jejich schopnosti odpovídat v citlivé buněčné linii. Zhodnotili jsme dva hlavní typy regulace - interakci sekvencí regulovaných železem s proteiny odpovídajícími na železo (IRE-IRP dráha) a tristetraprolinem (TTP) řízenou degradací mRNA přes oblasti bohaté na AU páry (ARE). Použitím přidávání a chelace železa jsme otestovaly buňky - za potvrzení IRE-IRP regulace těžkého řetězce ferritinu (FTH), transferinového receptoru 1 (TfR1), akonitázy 2 (ACO2) a za identifikace nových cílů IRE-IRP dráhy...
|
|
|
Metabolismus železa u parazitické améby Acanthamoeba castellanii
Krejbichová, Lucie ; Mach, Jan (vedoucí práce) ; Horáková, Eva (oponent)
Acanthamoeba castellanii je oportunní parazitická améba, která sice způsobuje onemocnění u člověka poměrně vzácně, nicméně léčba a diagnostika bývá komplikovaná. Způsobuje dva typy onemocnění, smrtelnou granulomatózní encefalitidu a zánět oční rohovky takzvanou acanthamoébovou keratitidu. Jedním z moderních způsobů zásahu proti parazitickým prvokům i dalším infekčním onemocněním je interference s metabolismem železa. Železo je pro živé organismy životně důležitým prvkem, který se účastní celé řady metabolických dějů. Zároveň je však pro organismy toxické, proto je jeho příjem, skladování a celková homeostáza uvnitř buňky striktně kontrolovaný proces. Na homeostáze železa uvnitř buňky acanthamoeby se podílí železitá reduktáza, fluorescenční mikroskopie ukázala, že je lokalizována do membrán vakuol a její aktivita se zvyšuje při snížení dostupnosti železa. Tento protein nejspíše zprostředkovává redukci iontů železa, které jsou využity v dalších buněčných pochodech a zejména při jeho transportu přes membrány. Zajímavé je, že snížená dostupnost železa nemá vliv na mitochondriální dráhy Fe-S klastrů, což jsme ukázali pomocí fluorescenční mikroskopie s protilátkou proti jednomu z proteinů této dráhy (IscU). Nedostatek železa nemá vliv na respiraci, snižuje se však aktivita alternativní oxidázy. Deprivované...
|
|
|
Proteomic Analysis of Trichomonas vaginalis hydrogenosone
Campo Beltran, Neritza ; Tachezy, Jan (vedoucí práce) ; Nohýnková, Eva (oponent) ; Yarlett, Nigel (oponent)
Trichomonas vaginalis je lidský parazit, který ročně ohrožuje přibližně 258 milionů lidí. U tohoto parazita byla popsána organela mitochondriálního původu nazvaná hydrogenosom, která je schopná vytvářet energii v podobě ATP za anaerobních podmínek. Zkoumání a popisování nových proteinů, vyskytujících se v této organele, může přispět k objevení nových cílů pro antiparazitární léčbu. Zároveň nám tento výzkum pomůže porozumět fungování a evolučnímu původu této odvozené organely. Dostupnost již popsaných protokolů pro izolaci hydrogenosomů společně s kompletně zmapovaným genomem T. vaginalis umožňuje studovat tyto organely pomocí moderních metod hmotnostní spektrometrie a bioinformatických analýz. V rámci našeho výzkumu jsme použili různé přístupy umožňující popsat proteiny v těchto organelách. Jednalo se o transkriptomické a proteomické analýzy zjišťující buněčnou odpověď parazita T. vaginalis na změny koncentrace železa v prostředí. A dále změny v obsahu proteinů hydrogenosomů u T. vaginalis rezistentních na metronidazol. Organely byly v obou případech izolovány pomocí diferenciální centrifugace gradientu OptiPrepu. Takto připravené hydrogenosomy byly analyzovány hmotnostním spektrometrem pomocí nano-RP- HPLC/MALDI-TOF/TOF. Zároveň jsme pomocí Tritonu X-114 oddělili membránové a matrixové proteiny a...
|
|
|
Chelating Polymers for the Haemochromatosis Treatment
Groborz, Ondřej ; Hrubý, Martin (vedoucí práce) ; Kotek, Jan (oponent)
4 Chelatující polymery pro léčbu hemochromatózy Autor: Ondřej Groborz Vedoucí práce: Mgr. Martin Hrubý, Ph.D., DSc. Konzultanti: Ing. Kristýna Kolouchová Ing. Pavel Švec Ústav makromolekulární chemie Akademie věd České republiky, v.v.i Abstrakt Hemochromatóza je skupina dědičných onemocnění, jež je charakterizována toxickým nahromaděním železa v orgánech. To může vést k orgánové toxicitě a nevratnému poškození. V současné době existuje pouze málo schválených léčebných postupů, z nichž všechny mají závažné nežádoucí účinky. V této práci navrhujeme nové paradigma léčby: nerozpustné a tedy biologicky nevstřebatelné polymery by vytvářely stabilní komplexy s železnatými či železitými ionty v gastrointestinálním traktu, čímž by snížily biologickou dostupnost železa. Nerozpustnost těchto polymerů brání jejich vstřebání a tím zamezuje vzniku systémové i orgánové toxicity. Bylo připraveno několik polymerů s kovalentně vázanou selektivní chelatační skupinou. Na základě dat získaných in vitro a in vivo byly vybrány ty chelatující skupiny, které byly dostatečně účinné pro případné klinické aplikace. Polymery vykazují zanedbatelnou vstřebatelnost, zanedbatelnou toxicitu, mají velmi vhodnou kinetiku in vitro chelatace železnatých i železitých iontů a mají prokazatelný terapeutický účinek na in vivo modelu. Proto by mohly...
|
|
|
Vliv chronické hypoxie na antioxidační kapacitu myokardu potkana.
Závišková, Kristýna ; Nováková, Olga (vedoucí práce) ; Žurmanová, Jitka (oponent)
Adaptace na chronickou hypoxii aktivuje endogenní signální dráhy vedoucí ke zvýšené odolnosti srdce k akutnímu ischemicko/reperfúznímu (I/R) poškození. Molekulární mechanismus tohoto jevu není zatím zcela objasněn. Bylo však prokázáno, že se v signální dráze kardioprotekce indukované chronickou hypoxií uplatňují reaktivní formy kyslíku (ROS), jejichž zvýšená hladina musí být přísně regulována antioxidačním systémem buňky. Cílem diplomové práce bylo sledovat vliv intermitentní hypobarické hypoxie (IHH, 7 000 m) na relativní zastoupení antioxidačních enzymů (peroxiredoxin 6 - PRX6, thioredoxin 1 a 2 - TRX1 a TRX2, thioredoxinreduktáza 1 - TRXR1) a rovněž enzymů metabolismu železa (hemoxygenáza 1 a 2 - HO1 a HO2, akonitáza 1 a 2 - ACO1 a ACO2), které se podílí na regulaci redoxního stavu buňky. Současně jsme stanovili vliv adaptace na IHH a antioxidantu tempolu na relativní množství na kalciu nezávislé fosfolipázy A2 (iPLA2). iPLA2 se jednak podílí na odstraňování peroxidovaných mastných kyselin z membránových fosfolipidů, na druhou stranu za I/R podmínek buňku spíše poškozují. Všechny enzymy byly stanoveny metodou Western blot v homogenátu z normoxického a na IHH adaptovaného myokardu levé komory potkana. Zjistili jsme, že se po adaptaci na IHH snižuje relativní množství PRX6 a naopak se zvyšuje množství TRX1...
|
|
|
Proteomická analýza v hematologickém výzkumu: identifikace alfa2-makroglobulinu jako specifického vazebného proteinu pro hormon hepcidin a změny proteomu leukemických buněk K562 v průběhu indukované diferenciace butyrátem sodným.
Pešlová, Gabriela ; Vyoral, Daniel (vedoucí práce) ; Krijt, Jan (oponent) ; Suttnar, Jiří (oponent)
Dizertační práce: "Proteomická analýza v hematologickém výzkumu: identifikace alfa2-makroglobulinu jako specifického vazebného proteinu pro hormon hepcidin a změn proteomu leukemických buněk K562 v průběhu indukované diferenciace butyrátem sodným" je postavena na proteomickém přístupu k identifikaci a funkční charakterizaci proteinů, které se účastní transportu hormonu metabolismu železa, hepcidinu v krevní plazmě a které se uplatňují při erytroidní diferenciaci modelových buněk linie K562. V první části se jedná o proteomické využití nedenaturujících, nativních separačních metod, zejména chromatografie a nativní elektroforézy, ve druhé části pak o porovnání proteomu kontrolních a butyrátem indukovaných buněk pomocí klasické techniky - dvojrozměrné SDS polyakrylamidové elektroforézy. Metody použité v dizertaci rozšiřují spektrum technik použitelných v experimentální hematologii. Dizertace spolu s publikovanými články pak přináší poznatky o nových proteinech důležitých pro metabolismus železa a diferenciaci červených krvinek. Klíčová slova: proteomická analýza, hepcidin, alfa2-makroglobulin, metabolismus železa, CML, K562, Na-butyrát
|
|
|
Molecular mechanisms of tamoxifen resistance in breast cancer
Tomková, Veronika ; Truksa, Jaroslav (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent) ; Mráček, Tomáš (oponent)
Rezistence k tamoxifenu, léčivu používaném v adjuvantní terapii při hormonální léčbě rakoviny prsu, představuje závažný klinický problém. Přestože byly popsány a intenzivně studovány různé mechanismy vedoucí k rezistenci k tamoxifenu, u značného počtu pacientů se objeví rezistence na terapii a následná recidiva. Ukázalo se, že léčba tamoxifenem obohacuje nádory o nádorové buňky podobné kmenovým bunkám, které jsou přirozeně rezistentní a mají schopnost sebeobnovy a potenciál vytvářet sekundární nádory. Metabolická plasticita, změněný metabolismus železa a zvýšená exprese ABC transportérů jsou další factory důležité při udržování fenotypu rakovinných kmenových buněk. Z tohoto důvodu jsme zkoumali výše uvedené mechanismy v dvou in vitro modelech tamoxifen rezistentních buněčných linii (Tam5R), které jsme zavedli. Ukazujeme, že Tam5R buňky mají dramaticky rozložené a méně aktivní mitochondriální superkomplexy a vyšší hladinu mitochondriálního superoxidu spolu s fragmentovanou mitochondriální sítí. Taková dysfunkce mitochondrií vede k aktivaci AMPK signální dráhy a metabolickému posunu směrem ke glykolýze. Navíc buňky bez funkčních mitochondrií (ρ0 buňky) jsou signifikantně více rezistentní k tamoxifenu, což podporuje úlohu mitochondrií v rezistenci k tamoxifenu. Naše analýza odhalila signifikantní...
|
|
|
Mechanisms of resistance and iron metabolism in cancer stem cells
Lettlová, Sandra
(CZ) Rakovinné kmenové buňky (RKB), stejně jako normální kmenové buňky v tkáních, zodpovídají za zachování a růst nádorů. RKB představují malou frakci buněk uvnitř nádoru, která je charakteristická vlastní obnovovací kapacitou a schopností vyvolat nádor v myších s nefunkčním imunitním systémem. U buněk se zvýšenými kmenovými vlastnostmi se předpokládá, že jsou odpovědné za rezistenci nádorů k léčbě, tvorbu metastáz a návrat nádorového onemocnění. První část této práce se zabývá rezistencí nádorů, která je často spojena se zvýšenou expresí "ATP-binding cassete" (ABC) transportérů pumpujících chemoterapeutikum ven z buněk. Pro účely této studie jsme použili in vitro model RKB založený na kultivaci buněk jako tzv. 3D "sféry". Expresní profil ukazuje, že náš model RKB odvozený z buněčných linií rakoviny prsu a prostaty exprimuje celkově vyšší hladinu ABC transportérů, zejména ABCA1, ABCA3, ABCA5, ABCA12, ABCA13, ABCB7, ABCB9, ABCB10, ABCC1, ABCC2, ABCC3, ABCC5, ABCC8, ABCC10, ABCC11 a ABCG2. Analýza proteinové hladiny ABC transportérů v RKB prsu pak ukázala vyšší expresi transportérů ABCB8, ABCC1, ABCC2, ABCC10 a ABCG2 a naopak snížení hladiny proteinů ABCB10 a ABCF2. V souladu s těmito daty, sféry připravené z buněčných linií T47D a MCF7 vykazují rezistenci k daunorubicinu a doxorubicinu, a zajímavě...
|
|
|
Molecular mechanisms of tamoxifen resistance in breast cancer
Tomková, Veronika ; Truksa, Jaroslav (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent) ; Mráček, Tomáš (oponent)
Rezistence k tamoxifenu, léčivu používaném v adjuvantní terapii při hormonální léčbě rakoviny prsu, představuje závažný klinický problém. Přestože byly popsány a intenzivně studovány různé mechanismy vedoucí k rezistenci k tamoxifenu, u značného počtu pacientů se objeví rezistence na terapii a následná recidiva. Ukázalo se, že léčba tamoxifenem obohacuje nádory o nádorové buňky podobné kmenovým bunkám, které jsou přirozeně rezistentní a mají schopnost sebeobnovy a potenciál vytvářet sekundární nádory. Metabolická plasticita, změněný metabolismus železa a zvýšená exprese ABC transportérů jsou další factory důležité při udržování fenotypu rakovinných kmenových buněk. Z tohoto důvodu jsme zkoumali výše uvedené mechanismy v dvou in vitro modelech tamoxifen rezistentních buněčných linii (Tam5R), které jsme zavedli. Ukazujeme, že Tam5R buňky mají dramaticky rozložené a méně aktivní mitochondriální superkomplexy a vyšší hladinu mitochondriálního superoxidu spolu s fragmentovanou mitochondriální sítí. Taková dysfunkce mitochondrií vede k aktivaci AMPK signální dráhy a metabolickému posunu směrem ke glykolýze. Navíc buňky bez funkčních mitochondrií (ρ0 buňky) jsou signifikantně více rezistentní k tamoxifenu, což podporuje úlohu mitochondrií v rezistenci k tamoxifenu. Naše analýza odhalila signifikantní...
|
|
|
Homeostáza železa u malárie
Wernerová, Klára ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; Voleman, Luboš (oponent)
Ačkoliv je malárie značně zkoumaným infekčním onemocněním, stále s ní nedokážeme dostatečně účinně bojovat, o čemž vypovídá poměrně vysoký počet nakažených. Existuje sice množství antimalarik, nicméně na řadu z nich vzniká rezistence, proto je třeba vyvíjet nová, účinnější léčiva. Jednou z možností je zacílit na parazitův metabolismus železa, esenciálního prvku všech organismů. Železo se účastní syntézy DNA, dýchání a výroby energie. Funguje jako kofaktor ribonukleotid reduktázy, metaloproteinů s FeS klastry nebo hemem. Během infekce musí paraziti s hostitelem bojovat o potřebné látky, a tedy také o železo. Mechanismus příjmu nebo vylučování železa u původce malárie není zatím zcela jasný, jsou známé pouze 2 transportéry železa a již nyní je zřejmé, že jich musí být více. Parazit rodu Plasmodium tráví velké množství hemoglobinu, který je následně degradován na volný hem a denaturovaný globin. Volný hem je však pro buňku toxický. Plasmodium se toxicitě volného hemu brání tvorbou chemicky inertního hemozoinu. Tento unikátní mechanismus ochrany před toxicitou volného hemu je pro Plasmodium i ostatní krevní parazity velice výhodný, protože ho však nesdílí se svým hostitelem, stává se rovněž výhodným cílem pro léčiva. Další možností chemoterapie je použití chelátorů železa. Chelátory vykazují dvojí...
|
host ::
RSS.